我们对DNA编纂控造手艺其实不孤独，那是两门专一性抗肿瘤发作改动遗传信息字符串的控造手艺。
近几年，DNA编纂控造手艺开展快速，从第二代DNA核酸编纂控造系统ZFNs、第二代TALENs到第三代CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)控造系统。
2012年zhang feng等人在体外解构了该控造系统而且在人类细胞核中证了然CRISPR/Cas9的DNA编纂才能，跟着控造手艺不竭改革，不单单是DNA卢瓦龙县，DNA填入的获得错误率变得越来越高[1]。
DNA编纂并没有被法令明令制止，只是人体伦理部门的试验被明令制止，当然违背伦理道德那事在任何控造手艺应用上都是不允许的，(我不晓得都敲了几十个DNA了也没人抓我啊：）)
DNA编纂除了在治疗上起感化，在各大生物化学试验室中也做为做为一种遍及的DNA编纂东西得到普遍运用，常用的就是将你钟爱的短片卢瓦龙县或是填入你的研究对象：大鼠、大鼠、基因学、寄生虫、各类动物，各类细胞核来展开研究。或是接纳贸易化的Lentiviral CRISPR gRNA Library日文版来展开钟爱残基的量谱甄选，好比筛个抗生素机理之类的。
责任编纂从选定DNA，构造设想字符串，到HIAA，甄选，判定到获得获得胜利的单细胞核LX1办事介绍，略过那一套，大要必要两三周之久。（若是碰到挫折也许会更久）
试验关键步调参考见variations，[2][3][4]责任编纂理论并颠末本试验室列位师兄师弟的心血获得不竭改良。可间接用于protocol接纳，字数许多！！图也许多！！只是钟爱的同窗看一下试验金属质料板块方可。
有问题欢送伴侣圈交换。
他们必要如下表所示金属质料：
最末目的细胞核，他们的客户。带有cas9的前言PX459（用以引入Guide字符串,买回镜像：http://www.addgene.org/108292/），关于难以HIAA的细胞核凡是接纳lentiGuide-Puro前言来展开慢病毒包拆（买回镜像：http://www.addgene.org/52963/），那是他们的小刀。Guide字符串：按照卢瓦龙县的DNA送公司合成（不是间接提取啦！），一般为20个核苷酸，卢瓦龙县的专一性和INS13ZD已经投弹效应取决于此，那是他们小刀长的眼睛。HIAA的抗生素：polyjet或是lipo2000,PEI等，那是将小刀送到细胞核里面的申通外卖。甄选的抗生素：嘌呤霉素（puromycin)用以甄选获得胜利HIAA前言的细胞核，那是查抄外卖送的售后办事老赵。一句话归纳综合就送个外卖的事~艾涅勒之后该控造系统就会主动启动了，并且DNA小刀会整合到DNA组上，意思就是一旦卢瓦龙县获得胜利那么那个细胞核的全人类都完蛋了，保留就冻存该细胞核就行。
卢瓦龙县获得胜利的细胞审定序成果为两个等位DNA都在PAM区前三个残基发作了核苷酸为非3倍数的缺失或是增加。
他们必要如下表所示软件：
UCSC: http://genome.ucsc.edu，用于下载最末目的DNA的全字符串2.构造设想guide的中文网站：源自利察区教师的中文网站：http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html
3.接纳的前言为pX459V2.0-eSpCas9(1.1)，能够在addgen官方网站间接买回
（http://www.addgene.org/108292/）。
详细关键步调如下表所示：
1.那是px459的图表，65美圆，你先拍两个。
那是两个一体化的构造设想：将辨识研磨残基的或后字符串gRNA和具有研磨功用的字符串Cas9毗连到两个前言上，接纳时只必要将该前言implantation到细胞核内部方可。
编码小刀CAS9的区域和用于辨识卢瓦龙县的残基的gRNA镜像到了两个前言上，图源自：http://www.addgene.org/108292/2.接下来介绍若何针对你的需求来构造设想gRNA并毗连到那个前言上。
起首翻开guide构造设想的网页：http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html（感激zhang feng lab供给的无偿接纳权）
中文网站截图3. 获得了必要的寡核苷酸短片根据分数从高到低摆列，那里给出的核酸字符串在第二列包罗20个核苷酸加上NGG，他们必要把那20个核苷酸以及它的标的目的互补字符串送去合成并加到之前提到的PX459字符串上。那里的构造设想已经把专一性INS13ZD和DNA可靠性都考虑了。他们只必要复造粘贴方可。
中文网站截图4. 为了将那20个核酸填入PX459前言，他们必要借助两个限造性内切酶BBSI把前言切出两个小口子，并包罗两个粘性末端。
然后将他们构造设想的的20个核酸两侧添加上互补的粘性末端。值得留意的是，PAM区也有可能呈现在反向字符串，那时构造设想gRNA就要反向添加粘性末端。
5. 履历一系列分子克隆的常规操做：酶切，毗连，转化，涂板，挑菌，抽量粒，送定序，定序获得胜利。至此他们已经把所必要的前言都构建完成了，接下来他们将该前言寄送到所要敲出的细胞核中，常用的办法包罗脂量体寄送，电转，或是显微打针。比力经济的办法就是HIAA，操纵HIAA试剂将量粒运进细胞核内。6孔板的细胞核，大约500ng量粒足够。
6. 运进细胞核后，或后字符串辨识DNA组上的PAM区（NGG），而且毗连到DNA组上，CAS9起头工做并研磨。
RNA引导的Cas9核酸示企图。DOI:10.1038/nprot.2013.1437. HIAA后48小时，改换含有puromycin（嘌呤霉素）的培育基，甄选HIAA获得胜利并表达该量粒的细胞核，因为前言上带有嘌呤霉素抗性，所以只要HIAA获得胜利的细胞核可存活。甄选浓度按照差别的细胞核展开调整。
8. 甄选完毕以后，手动或是流式分选将单个细胞核分选到96孔板中，静置2周或是3周期待单克隆细胞核长成单群落。然后挑选初筛查抄被卢瓦龙县的卵白能否表达，进一步挑选单克隆细胞核展开定序。若是是展开DNA敲减试验，间接用第6步最末甄选的pool细胞核做试验也可。单克隆甄选是为了获得突变均一的细胞核系。
9. 因为Cas9控造手艺尽管切不管修，所以修复过程在差别的细胞核是纷歧样的，定序成果也千差万别，他们认为卢瓦龙县获得胜利的细胞审定序成果为两个等位DNA都在PAM区前三个残基发作了核苷酸为非3倍数的缺失或是增加。
该试验成本很低但是效率很高，那也是该控造手艺可以快速在各个试验室得到普遍操纵的全数理由，只必要送合成sgRNA那里必要花钱，20个核苷酸也就是几块钱，其余的包罗细胞核培育，甄选，定序全套下来仍是十分经济的。
我本身做的一般96孔板一块板子能够挑选出来60%的单细胞核（他们试验室手动分选可能会细胞核间污染），最初定序获得胜利被证明为能够继续接纳的细胞核也在10%以上。
参考^1 https://doi.org/10.1038/nprot.2013.143^2 https://doi.org/10.1126/science.1247005^3 https://www.nature.com/articles/nmeth.3047^4 https://science.sciencemag.org/content/343/6166/84