图片来自：http://nature.com
导语：
每年的岁末岁首年月，《天然》杂志旗下子刊《天然·办法》（Nature Methods）城市清点昔时的年度科学手艺。2015年最受存眷的手艺为冷冻电镜手艺（cryo-EM），此前呼声很高的CRISPR/Cas9基因编纂手艺未能折桂。
在冷冻电镜的那场手艺革射中，华人科学家功不成没，在某些方面以至独领风骚，做出了诸多严重功效。
文 | 张凯（剑桥大学MRC分子生物学尝试室博士）
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细胞里面的生命活动有条有理，每一个部门都有其特定的构造，承担差别的功用。生物大分子则是一切生命活动的最末施行者，它们次要是核酸和卵白。核酸照顾了生命体的遗传信息，而卵白是生命活动的次要施行者。自现代分子生物学降生以来的半个世纪里，解析和阐发生物大分子的构造、进而阐释其功用机造不断都是现代生命科学的核心问题之一。
事实上，一切天然科学都涉及物量构造及构造间的彼此感化为核心的研究标的目的，天文学研究宇宙、星体等的构造及其彼此感化，粒子物理研究物量世界的根本粒子的构造和彼此感化，以至包罗应用性很强的质料科学都是以研究新型质料的构造和性量等为核心。构造生物学研究的间接目标是弄清晰生命大分子构造，从而更好天文解生命，理解那个天然界中“逆热力学第二定律”而降生的奇观；最末目的是公家凡是关心的适用价值。
像数学物理公式不会间接造出飞机、导弹、计算机一样，卵白量构造如许的根底研究不会间接转化为人们消费生活的必需物品。比力详细的应用，如药物设想、疫苗开发、医疗诊断和卵白量分子性能革新（如科学尝试或工业消费中酶活性不变性优化）等是卵白量构造研究比力容易被群众所理解的一个标的目的，但却只是其研究价值的一个侧面罢了。
卵白量构造好像生命科学里的数学公式和物理定律，以至在以后会充任生命科学里面的“化学元素周期表”，除了帮忙发现或设想新药等，它更重要的价值是做为最根底最上游的研究之一，通过影响一切与其亲近相关的下流科学和手艺，从而改动我们的世界。
构造生物学最早降生于上个世纪中叶，它是一门通过研究生物大分子的构造与运动来阐明生命现象的学科，在其开展史上有两个里程碑式的事务，一个是DNA双螺旋构造的发现，另一个肌红卵白（Myglobin）晶体构造的解析，那两个事务都是上个世纪最重要的革命性科学停顿，均在剑桥MRC分子生物学尝试室完成，而且都于1962年获得了诺贝尔奖（一个心理学或医学奖，一个化学奖）。同时它们都是最早利用X射线的办法来解析生物大分子构造，而那个办法在过去半个世纪里，不断占据构造生物学的统治地位。
在当今构造生物学研究中遍及利用的冷冻电镜，是上个世纪七八十年代起头呈现、近两年飞速开展的革命性手艺，它能够快速、简易、高效、高分辩率解析高度复杂的超大生物分子构造（次要是卵白量和核酸），在很大水平上代替而且大大超越了传统的X射线晶体学办法。
革命性的冷冻电镜手艺
冷冻电镜并非那两年才成立的。在卵白量X射线晶体学降生大约10多年以后的1968年， 做为里程碑式的电镜三维重构办法，同样在剑桥MRC分子生物学尝试室降生，Aron Klug传授因而获得了1982年的诺贝尔化学奖。另一些打破性的手艺在上世纪70年代和80年代中叶降生，次要是冷冻成像和卵白快速冷冻手艺。那里面的代表科学家有Ken Taylor, Robert Glaeser和Jacques Dubochet等。
快速冷冻能够使卵白量和所在的水溶液情况敏捷从溶液态改变为玻璃态，玻璃态能使卵白量构造连结其天然构造形态，若是以迟缓暖和的体例冷冻，那个过程会构成晶体冰，生物分子的构造将被晶格力彻底损坏。低剂量冷冻成像可以保留样品的高分辩率构造信息，确保了从电镜图形中解析卵白量构造的可能性。与此同时Joachim Frank等则在电镜图像处置算法方面奠基和开展了那项手艺的理论根底。由此冷冻电镜的雏形根本成立，总的思绪为：
1）样品冷冻（连结卵白溶液态构造）；
2）冷冻成像（获取二维投影图像）；
3）三维重构（从二维图像通过计算得到三维密度图）。
该办法为生物大分子构造研究供给了一个和X射线晶体学完全纷歧样的、全新的思绪。但是因为手艺办法的瓶颈，在尔后30多年的时间里只能做一些相对低分辩率的构造解析工做，在分辩率上不断不克不及和X射线晶体学比力，以至一度被讪笑为”blob-ology“（英文挖苦语，“一坨轮廓的手艺”）。
动力卵白激活因子dynactin冷冻电镜原始照片。张凯供图
颠末图像分类和均匀后的二维投影图。张凯供图
冷冻电镜三维重构得到的电子云密度图和原子模子(部分)。张凯供图
但关于冷冻电镜来说，手艺难点远非单纯冷冻。冷冻成像和图像处置算法不断都是瓶颈。从冷冻电镜手艺降生以来的近30年时间里，其不断都有停顿，只是相比照较迟缓。
最重要的革命性事务大约发作在两三年前：一个是间接电子探测器的创造，另一个是高分辩率图像处置算法的改良。MRC分子生物学尝试室的两位科学家Richard Henderson和Sjors Scheres在此次革射中起了关键感化（做者注：现代科技革命往往是诸多研究机构若干团队配合参与，此处仅列举关键代表，而且仅从手艺角度讨论，不涉及生物学应用）。
Richard Henderson是探测器方面的前驱，而Sjors Scheres则因他设想的Relion法式而名声大噪，他们由此被选为《天然》杂志2014年“十大科学停顿年度人物”。两位科学家一个从硬件，一个从软件将冷冻电镜手艺推向了巅峰，将冷冻电镜手艺的分辩率推向了新高度。（做者注: Henderson传授的奉献远非探测器一个方面，包罗冷冻电镜理论根底、算法、软件，重要生物大分子应用，如曾初次解析视紫红量跨膜螺旋等等方面；早在20多年前，他就通过一系列理论阐发，预言了冷冻电镜研究的标准、分辩率极限、手艺瓶颈等等，而且断言：冷冻电镜将超越其它一切手艺办法，成为卵白量构造研究的主导东西，现在那些预言全数应验。）
和此前利用的CCD比拟，新开展的间接电子探测器不只在电镜图形量量上有了量的飞跃，同时在速度上大幅进步，还能够以片子的形式快速记录电镜图像。那些特征同时也陪伴着电镜图像处置方面的严重变化，电镜手艺此前在分辩率上的一个次要瓶颈是电子束击打生物样品形成的图像漂移和辐射损伤。有了快速片子记录，我们就能够逃踪图像漂移轨迹而对图像做运动矫正和辐射损伤矫正，大大进步数据量量。
虽然如斯，电镜图像处置不断都是一项极具挑战性的使命，次要的问题是冷冻电镜的图像噪音极高、信号极低，而我们的目的是从中提取近原子分辩率的构造信息，那就像在一个机器轰鸣的工场里监测一隻蚂蚁爬行的声音。冷冻电镜科学家就是要完成那项艰巨的使命，而且实的做到了。有了硬件和软件方面的双重进步，冷冻电镜的分辩率目前已得到了极大的进步，能够和晶体学相媲美；而且在其它方面已经大大超越了晶体学。
次要表现鄙人面几个方面：
第一，不需要结晶，研究对象范畴大大扩展，研究速度大大进步。关于小分子，例如说无机盐矿物量等自觉就能长出晶体，小并且不变的卵白量目前来说结晶其实不困难，但是那类意义严重的卵白几乎都已经解析完了，在科学上没有任何严重意义；当今时代，小卵白已经完全不克不及满足科学家们强烈的摸索欲望，构造生物学研究的对象越来越大，系统越来越复杂，结晶几乎成为不成能的工作，即便能结晶，也纷歧定衍射，有衍射也纷歧定能得到原子分辩率构造。
良多年前，许多卵白量晶体科学家为了完成一项艰巨的使命，一个课题少则5到10年，多则20年，核糖体从上世纪80年代初初次长出晶体到2000年摆布最末拿到原子分辩率构造整整履历了20年；线粒体呼吸链复合物I从上世纪90年代初研究，第一则报导完好晶体构造大约是20年以后。
而冷冻电镜办法跳过超大分子复合物结晶难的那层手艺屏障，以间接解析复合物的溶液形态的构造为目的。
如今操纵那项手艺，在MRC-LMB一周时间就能够解析一个新的核糖体构造；英国皇家学会主席、MRC-LMB构造中心主任Venki Ramakrishnan 传授，因为核糖体的晶体构造研究而获得2009年诺贝尔化学奖。他的尝试室在2014年颁发了最初一篇晶体构造文章，尔后的文章全数以冷冻电镜为主。哥伦比亚大学有一个十分固执的博士后，研究兰尼碱受体（Ryanodine Receptor）晶体构造长达十年之久，最初放弃了晶体，转向了冷冻电镜手艺，同时与清华大学传授颜宁和LMB的Scheres研究组合做，几个月就处理了那个难题，而且到达近原子分辩率。
第二，样品需求量小，样品造备快，可反复性高。重要生物样品都长短常珍贵的，总体来说是以微克或者最多以毫克来计量，即便得到那点样品，也要破费生物学家几周、几个月以至更长的时间（大大都时候都需要试探各类前提使样品处于相对不变的形态，以便做进一步构造研究）。
卵白量晶体一般要求高浓度大致积，没有量变就没有量变。而同样量的卵白能够稀释以后造备若干冷冻电镜样品，每个样品有成百上千的区域，每个区域有几百个小孔，每一个小孔以至能够搜集多张照片。解析一般卵白的原子构造需要几万个颗粒，而关于高对称性的样品几千个颗粒就足够。
第三，能够研究天然的、动态的构造。X射线晶体学研究生物大分子构造的一个次要弱点是无法拿到天然的动态的构造，那是因为研究人员无论若何也无法绕开结晶那个过程。冷冻电镜就是要做那件工作：间接解析天然的、溶液态的、动态的（dynamic），以至原位(in situ)的构造，从而理解生命分子若何在空间和时间两个标准上以活的动态的体例阐扬功用。
晶体学只能测验考试差别的前提获得生物大分子某个或者某些固定的形态，并且容易呈现晶体堆积引起的不实在彼此感化体例。形象地说，冷冻电镜能够造做完好的高清片子，晶体学只能从片子里截屏。
第四，手艺革命还将开启庞大的潜在医疗价值。冷冻电镜手艺办法在时间和精度方面的大幅度进步有时会招致不成预测的严重科学和应用价值。好比，活体病毒构造阐发若是能够在分钟级别完成，那将有可能转化为潜在的医疗检测手段：从病人体内抽取血样或传染组织细胞，几分钟以后，十分明晰了然地展示病人在细胞内部构造层面的异常情况，以至给出部分的原子构造图，从而给出精准的治疗计划。那个设法如今可能听起来有点像笑话，或许再过若干年人们就不如许认为了。
当然冷冻电镜的革命性不单单表现在上述四方面，在此就纷歧一列举。有关冷冻电镜愈加详细的介绍，可拜见笔者等2010年的中文综述（《生物物理学报》，2010年7月，第26卷，第7期: 533-559）。文章中对将来几年的开展趋向所做的瞻望，如间接电子探测器的普及、非对称性卵白复合物近原子分辩率构造解析、冷冻电镜相关计算性能的大规模提拔等等，目前绝大大都都在过去的两三年内得以实现并飞速开展。
华人学者在冷冻电镜范畴的奉献
在冷冻电镜的那场手艺革射中，华人科学家功不成没，在某些方面以至独领风骚，做出了诸多严重功效。
加州大学旧金山分校（UCSF）的华人科学家程亦凡传授在2013岁尾，初次操纵冷冻电镜手艺解析近原子分辩率膜卵白构造，那项功效在业界引起了庞大颤动。原因在于当所有电镜构造生物学家还在讨论膜卵白到底能不克不及操纵冷冻电镜手艺看到二级构造，也是凡是我们认为的中等分辩率程度的时候，程亦凡传授研究组间接解析了TRPV1 那个膜卵白3.3埃近原子分辩率的构造（Nature，504：107–112）。
笔者曾在该文章颁发的半年前在一次国际会议上和冷冻电镜范畴顶级学者深切讨论过若何获得明晰的膜卵白α-螺旋构造，对方给出了灰心的结论：“恐怕不太可能，至少比来两年不成能”。
事实上，此前卵白量晶体学家已经有所耳闻“冷冻电镜可能在将来几年会超越而且代替晶体学”，但是谁也没想到会是以如许快速和震撼的体例退场，那在某种水平上引发了很多卵白量晶体学家的“职业恐慌感”。那项功效的两个配合第一做者廖茂福、曹尔虎也都长短常出色的青韶华人科学家。
加州大学洛杉矶分校的周正洪传授早在2008年到2010年摆布，在那场电镜手艺革命降临之前，在各项手艺前提尚未成熟的情况下解析了一系列近原子分辩率病毒构造。其时接纳的是传统胶片来成像，使命十分艰巨，连他还在上学的儿子也都帮手一路洗胶片。张兴博士在那一系列稍早的重要功效中充任了前锋。早在2008年，第一个近原子分辩率的冷冻构造，也即3.8埃轮状病毒就是张兴博士做为第一做者完成的（PNAS, 105(6): 1867-1872）。从1968年Aaron Klug创建电镜三维重构理论，到2008年人们初次看到通过冷冻电镜获得近原子分辩率构造，整整用了40年。
在国内，清华大学的隋森芳院士是我国冷冻电镜范畴的前驱，不只德高望重，还培育了一多量优良的青年科学家，包罗清华大学的王宏伟传授以及MRC-LMB的白晓晨和畅磊福博士等等。王宏伟早年在隋教师尝试室做研究生的时候，在我国研究设备和前提全面落后于国外的情况下照旧做出了许多十分超卓的工做。
MRC-LMB的多位青韶华人研究人员对冷冻电镜开展都做出了重要奉献。白晓晨博士在MRC-LMB初次利用间接电子探测设备Falcon I和Sjors Scheres博士的新法式Relion，获得了第一个不合错误称样品核糖体的近原子分辩率冷冻电镜构造，打响了冷冻电镜革命的第一枪，随后解析了一系列核糖体和卵白复合物构造。畅磊福博士在LMB初次获得非核糖体不合错误称卵白样品APC复合物的近原子分辩率构造，阐了然卵白量泛素化的重要机理。笔者次要在LMB的Andrew Carter博士尝试室处置动力卵白构造和功用研究，并胜利解析动力卵白激活因子Dynactin构造，提出了目前为行动力卵白最详尽可靠的运动和激活机造（Science, 347(6229):1441-1446. 封面文章），同时独立开展冷冻电镜手艺办法。
1953年4月25日，MRC沃森和克里克在《天然》杂志颁发DNA双螺旋构造，61年后的统一天，我国科学家、中科院生物物理研究所的墨安然平静李国红研究员在《科学》杂志以长文形式颁发了30nm染色量冷冻电镜构造（DNA双螺旋之双螺旋）（Science , 344(6182): 376-380）。那项工做是冷冻电镜在核心生命科学问题中的胜利应用，冷冻电镜部门的工做次要是笔者在生物物理所的同窗宋峰博士完成的。
生物物理所的程凌鹏博士（当前单元为清华大学）获得国内本土第一个原子分辩率的冷冻电镜构造，构建了蚕多角体病毒（CPV）的完好三维原子模子（PNAS，108(4)：1373-1378）。笔者也参与了部门工做, 被其高量量、清洁的电子密度图震撼。近期程凌鹏与刘红荣博士合做，在国际上初次颁发了CPV完好基因组和RNA聚合酶“原位三维构造” (Science, 2015, 349(6254):1347-50), 引起了很大颤动，那项功效是我国本土冷冻电镜手艺和生物学应用的双重打破，被多名同业科学家称赞为”里程牌式发现“。
我国出名科学家施一公比来颁发了一系列严重卵白复合物的冷冻电镜构造，包罗γ-secretase、spliceosome等，被誉为过去几十年我国科学家对根底生物学范畴的更大奉献。
别的，在欧美和中国本土还有一多量华人学者在冷冻电镜或亲近相关范畴（cryoET等）做出诸多打破性功效，例如匹兹堡大学的张佩君传授（艾滋病毒构造研究），德克萨斯大学的刘俊传授（细菌运动，噬菌体构造等研究）等，因为时间和篇幅问题，无法逐个介绍。
冷冻电镜的将来瞻望
冷冻电镜手艺目前仍然在快速开展中，将来冷冻电镜能做什么取决于那项手艺能开展到什么水平。现代科学手艺革命的一个更大特点是开展速度极其敏捷，谁也不晓得明天会发作什么，当然也不克不及非常准确的预知一个范畴的开展标的目的。即使如斯，笔者仍是对那个范畴有一些预测或等待（仅手艺角度，不涉及详细生物学研究）。
1）超大规模、超快速度数据收罗和处置。和晶体学比拟，冷冻电镜的效率在某些方面已经异常惊人。好比笔者近期与牛津大学王祥喜博士合做，在几个小时以内就能够拿到完好甲肝病毒原子构造，而此前王祥喜博士破费近一年时间结晶才最末拿到原子构造。但是科学手艺开展是永无行境的……
但目前来说，构造生物学的庞大转型必需成立在速度和效率的双重前提下。那需要硬件、软件以及其它穿插学科等多方面的配合开展。
除了生物学研究应用，笔者不断努力于冷冻电镜手艺的开展，比来在进步电镜数据处置成果可靠性和分辩率前提下，上千倍地进步了此中几个环节，过去几百到上千CPU小时的工作，如今几分钟到几非常钟就完成了。但是那只是部门环节，在其它方面照旧十分耗时，整个手艺的各个环节若何全面高效高速地完成还需要更多的优良人才参与。对硬件的开展方面笔者并非很熟悉，估计在将来会呈现超高速度的电子显微镜，大幅度进步电镜原始数据的数量和量量。
2）大标准、高分辩率、高动态的生物大分子构造解析。理论上，冷冻电镜可像高清数码摄像机拍片子一样对生物大分子成像和重现其动态构造，研究深层机理。就目前而言，那一方面在手艺上远未成熟。大标准、高分辩率、高动态那几点拆解开来，每一个都不算太难，但是同时满足那几项需求几乎成为不成能的工作。但是那是将来构造生物学的标的目的，我们不单单要看简单的几张静态照片，我们还想看高清片子。
关于那一点，笔者需要强调一下构造生物学和动力学模仿的区别。构造生物学的动态构造目标是以尝试手段完好复原天然形态的动态构造，理解此中机理，是从尝试数据动身“重现大天然原貌”的过程，是完完全全可靠的尝试成果。而动力学模仿是从已有的理论或经历性的物理学规律动身预测一个生物大分子的动态特征，存在庞大的不确定性，其成果可靠性较差。等待在将来的某个时刻，两者会像上个世纪的理论物理和尝试物理一样完美地连系，彼此促进。
大标准复杂生物系统的高分辩率、动态机理研究涉及诸多学科，不是冷冻电镜一项手艺就能够完成的，需要多学科科学家配合参与完成。
3）高分辩单分子及原位构造研究。目前的构造生物学，无论晶体学、冷冻电镜仍是核磁共振次要仍是在研究“群体”构造。冷冻电镜相对晶体学在那一方面已经有了大幅度进步，能够通过火类的办法研究群体构造中的每一类构造。但现实上每个分子在时间和空间上除了共性，也一定有特征，若是一个办法强大到能够测得单个分子的高分辩率构造，那一定招致庞大革命，使得人们发现许许多多在群体构造研究条理上无法发现也无法理解的大量规律。
留意那里强调的是单分子“高分辩率”构造，而不单单是单分子构造。单分子构造我们目前能够利用好比冷冻断层成像（cryoET）的手段获得，但是分辩率十分低，在如斯低分辩率情况下，别说个别差别，良多群体构造差别都值得严峻量疑。或许冷冻电镜手艺若干年以后会实现那个目的，或许永久都不成能，或许那个目的被别的一个全新的手艺彻底代替，冷冻电镜从此退出汗青舞台。
冷冻电镜：一个高度穿插的学科
冷冻电镜范畴不断是多学科高度穿插和彼此促进才降生的一个奇观。数学、物理、化学、质料、计算机、软件、机械及主动化、细密仪器仪表等等缺一不成，当然最末的核心是生命科学（做者注：此处仅从构造生物学角度阐发，并不是泛指一般意义上生命科学是一切学科的核心）。生命科学提出问题，其它所有学科彼此连系产生更好的处理计划。通过那些处理计划，发现更多奥秘的生命现象，从而提出新的问题，降生新的手艺。
举个例子，冷冻电镜图像信噪比极低，没有科学家的雄心壮志，没有多量信号阐发、图像处置以至数学家的参与是不成能完成如许艰巨的使命。同时冷冻电镜范畴的一些发现或需求，也为其它范畴的科学家供给灵感来源和新的研究思绪。MRC-LMB做为现代分子生物学的发源地和近两年来飞速开展的冷冻电镜手艺核心研究机构，其一大特点就是多学科“零间隔穿插”。从半个世纪前的DNA双螺旋模子、肌红卵白晶体构造比及近两年冷冻电镜手艺革命，不断将那一理念表现得淋漓尽致。手艺的开展和严重科学问题的处理几乎都是同时停止的，当然科学问题或应用价值始末是核心和最末驱动力，离开科学和应用需求的手艺开展是没有意义的。
别的一个比力详细的例子是笔者此前思虑过的一个问题。在电镜范畴呈现间接电子探测设备之后，MRC-LMB的两台高端电镜，每天产生5到10T的数据量，近期正在调试第三台，也许不久的未来，超大数据、超快速度电镜就会投入消费，那些将会招致全世界各个研究机构遍及呈现一个严峻的手艺问题，就是若何高效、无损、快速地停止数据压缩存储和数据处置，当然那里的无损是相对特定生物样品和特定目的分辩率而言。那或许会引起一些信号处置和图像压缩方面的研究人员的兴趣。
跟着冷冻电镜对生物大分子复合物高分辩率构造研究趋于成熟，愈加复杂的动态机理研究是一定趋向，那是冷冻电镜手艺开展的一个潜在可能性。但是复杂生物系统的深切研究需要处理一系列数学理论、物理、计算难题，有的可能以至超出了那些学科目前的研究范围。近些年比力现实可行的是通过冷冻电镜手段，对特定卵白复合物非随机情况下的高分辩持续动态构象停止阐发。笔者认为，专业数学家的参与会大大加速冷冻电镜手艺在那些方面的开展。
生命体高度复杂，充满良多未知的和未被论述清晰的规律，那里面有成千上万的生物大分子复合物，每一个复合物又与其它若干分子或复合物彼此感化、彼此影响，深切再深切天文解生命素质不断城市是冷冻电镜的重要标的目的。冷冻电镜是强大的根底研究手段，它通过解析高度复杂的生物大分子构造，帮忙人们更好天文解生命规律，从而影响生命科学相关的一切下流学科和手艺，当然也包罗更好的发现和设想药物、医疗诊断等详细应用。我们等待在不久的未来，冷冻电镜手艺会对科学研究和社会开展等方方面面都产生庞大影响。
参考链接
MRC-LMB官方网站：
http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/
http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/achievements/lmb-nobel-prizes/
Aaron Klug（初次创建电镜三维重构办法）
Aaron Klug
《The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology》
The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology : Nature News & Comment
Method of the Year 2015
Table of contents : Nature Methods
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